功能性饮料，是指饮料中添加维生素、氨基酸、膳食纤维等各种功能性成分，从而使其具有保健功效[1]。随着消费者保健意识增强和运动需求增加，功能性饮料增长迅速。未来五年，功能饮料市场预计复合增长率将超过12%。
维生素B1、维生素B2是部分功能性饮料的主要有效成分。维生素B1，即硫胺素（thiamine），是机体代谢不可缺少的一种水溶性维生素。硫胺素主要贮存在细胞内，参与细胞的三羧酸循环（细胞有氧代谢的核心环节）和磷酸戊糖途径代谢（能量代谢与细胞的脂质及核酸代谢）[3,4]。运动后，适当补充含维生素B1的功能性饮料可减少丙酮酸、乳酸堆积，减少运动后疲劳的产生，提高耐力运动能力[5,6]。维生素B2，即核黄素（riboflavin），是黄素辅酶的主要成分，直接参与机体复杂的生物氧化过程[7]。一般情况下，人体能够从饮食中获取维持正常生理机能所需的核黄素，但在运动过渡情况下会引起机体内核黄素的丢失，而且运动诱导的自由基损伤和氧化损伤涉及全身许多器官和组织，影响机体生长发育和脑功能，进而影响运动能力[8,8,9]。
虽然部分功能性饮料添加有维生素B1、维生素B2等功效成分，能提高人体运动能力，但是根据我国GB24154-2015《食品安全国家标准运动营养食品通则》对运动营养食品可添加的营养素中维生素B1、维生素B2规定分别限定在0.2 mg～4 mg、0.2 mg～2 mg（以每日计），因此功能性饮料中不能过量添加维生素B1、维生素B2。目前测定维生素B1、维生素B2的方法主要包括荧光分光光度计法[10]、高效液相色谱法[11,12,13]和液相色谱-串联质谱法[14,15]等，而较多实验室主要依据GB5009.84-2016《食品安全国家标准食品中维生素B1的测定》、GB 5009.85-2016《食品安全国家标准食品中维生素B2》两种方法单一测定，较少建立同时测定功能性饮料中维生素B1、维生素B2的方法，单一测定检测耗时长、效率低，不能满足多种检测的需求。
鉴此，本文以功能性饮料中含有的维生素B1、维生素B2为检测对象，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法进行梯度洗脱及优化检测方法，并对建立的方法进行验证分析，以期建立可以同时测定维生素B1、维生素B2含量的方法，提高实验室分析检测效率。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
维生素B1、维生素B2（纯度≥98%）：中国食品药品检定研究院；乙腈：天津市科密欧化学试剂有限公司；三氟乙酸：永华化学科技（江苏）有限公司；盐酸：利安隆博华（天津）医药化学有限公司；氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂，以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器
1220高效液相色谱：安捷伦科技有限公司；MilliQ超纯水系统：Millipore公司；Vortex-Genie 2涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ300E超声波清洗器：上海精密仪器仪表有限公司；SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵：上海知信实验仪器技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 溶液及标准品的配制
1.2.1. 1 溶液的配制
根据参考文献[16,17]的方法，进行配制0.1%三氟乙酸溶液、0.5 mol/L盐酸溶液、0.1 mol/L盐酸溶液及2 mol/L氢氧化钠溶液。
1.2.1. 2 标准品的配制
根据参考文献[17]的方法进行配制维生素B1、维生素B2的标准品。
1）维生素B1标准贮备溶液的制备：准确称取维生素B1标准品0.080 0 g，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解，超声15 min，待全部溶解后，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL棕色容量瓶中。该标准贮备中维生素B1的浓度为1 600μg/mL。
2）维生素B2标准贮备溶液的制备：准确称取维生素B2标准品0.040 0 g，加2.5 mL的2 mol/L氢氧化钠溶液溶解，超声待全部溶解后，加30 mL水，再加1.2 mL冰乙酸，用水定容至50 mL棕色容量瓶中。该标准贮备中维生素B2的浓度为800μg/mL。
3）混合标准工作溶液：分别准确移取维生素B1、维生素B2标准贮备溶液10.00 mL于同一100 mL棕色容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液定容。该溶液中维生素B1、维生素B2浓度分别为160、80μg/mL。
吸取0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL的标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液定容至10 mL，得到混合标准工作溶液中维生素B1溶度为0、4、8、16、40、80μg/mL；维生素B2浓度为0、2、4、8、20、40μg/mL。
标准品及样品处理：吸取2 mL标准品液、样品液用0.22μm微孔滤膜过滤，待进样。
1.2.2 色谱条件
色谱柱：C18(4.6mm×150 mm,5μm）流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；波长：280 nm；检测器：紫外检测器（UV-detector）；流动相：A为0.1 mol/L三氟乙酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
1.2.3 标准曲线绘制
精密吸取1.2.1.2中的维生素B1、维生素B2混合标准工作溶液，按照1.2.2进行测定，以标准物浓度（X）为横坐标，其对应峰面积值（Y）为纵坐标，建立标准曲线。
1.2.4 检出限和定量限
将维生素B1、维生素B2混合标准溶液进行梯度稀释后分别进样检测，以信噪比S/N=3时的进样溶液浓度为最低检测浓度，即检出限（limit of determination,LOD）；以信噪比S/N=10时的进样溶液浓度为最低定量浓度，即定量限（limit of quantification,LOQ）。
1.2.5 精密度和回收率
随机抽取6份同浓度的混合标准品（维生素B1:16μg/mL；维生素B2:8μg/mL）连续进样6次，以峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）来表征仪器的精密度。
采用已知维生素B1、维生素B2含量的样品进行加标，以0.5、1.0、1.5倍的3个水平加标试验，以外标法计算加标回收率和RSD，每个浓度值重复进样3次。
1.2.6 稳定性试验
取同一供试样品溶液，在室温25℃条件下存放，每相隔24 h，按照1.2.2方法进行试样测定，连续测定3 d。
1.2.7 样品测定
通过建立的HPLC法对市场上2种功能性维生素饮料中维生素B1、维生素B2含量进行测定，样品平行测定2次。
1.3 数据处理
色谱数据分析采用仪器自带软件Agilent ChemStation进行处理。所有线性方程、精密度及回收率试验的数据均由WPS Excel 2016处理得出。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的确定
参考张憬等[18]和张媛媛等[19]测定维生素B的方法，得出246、267、280 nm 3个理想波长数据，经过检测发现，在280 nm条件下同时测定维生素B1、维生素B2，基线稳定，组分出峰理想，故选择280 nm波长采集数据。
经相关文献调研[20]，高效液相中比较常用的流动相一般为0.1%三氟乙酸（调节pH值）-乙腈或甲醇-磷酸盐缓冲溶液，但由于甲醇-磷酸盐缓冲溶液体系中盐浓度较高，如果试验后不及时冲洗色谱柱会出现结晶，容易造成色谱柱堵塞，且对仪器要求较高，所以出于保护色谱柱，选用0.1%三氟乙酸-乙腈作为流动相进行试验，试验过程中样品出峰时间短，并且峰形分离度高且对称，无拖尾峰。
根据文献[21]调研和考虑柱压对色谱柱使用寿命的影响，在实际试验操作中确定高效液相色谱的流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。
2.2 维生素B1、维生素B2标准曲线
维生素B1、维生素B2混合标准工作溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪，以标准物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制维生素B1、维生素B2的工作曲线如图1，并计算回归方程。结果得出维生素B1、维生素B2的线性方程分别为Y=8.145 9X+0.318 1，相关系数R2=0.999 98;Y=30.785X+0.121 5，相关系数R2=0.999 99；表明维生素B1浓度在0～80μg/mL范围内具有良好的线性关系，维生素B2浓度在0～40μg/mL范围内具有良好的线性关系。
图1 维生素B1、维生素B2标准曲线图
图1 维生素B1、维生素B2标准曲线图 下载原图
图1 维生素B1、维生素B2标准曲线图
2.3 维生素B1、维生素B2检出限和定量限
通过一系列梯度稀释后，确定了维生素B1、维生素B2的检出限分别为0.002 8、0.000 60μg/mL，定量限分别为0.009 2、0.001 8μg/mL，说明本检测方法灵敏度较高。
2.4 精密度和回收率
通过对6份同浓度的维生素B1、维生素B2混合标准品（维生素B1:16μg/mL；维生素B2:8μg/mL）连续进样6次，其峰面积及精密度见表2。
表2 精密度测试结果
由表2可知，维生素B1、维生素B2的RSD分别为0.50%、0.77%，说明此法精密度较好，可适用于同时测定维生素B1、维生素B2。
通过对已知维生素B1、维生素B2含量的样品进行加标，向已知样品维生素B1加入0.60、1.20、1.80 mg/100 mL低、中、高3个不同浓度的维生素B1标准品，向已知样品维生素B2加入0.34、0.68、1.02 mg/100 mL低、中、高3个不同浓度的维生素B2标准品，以外标法计算，其加标回收率和RSD见表3。
表3 加标回收率测试结果
由表3可知，回收率在94.12%～98.53%之间，RSD在0.32%～0.84%之间，说明此法重现性较好，可以被推广。
2.5 稳定性试验
通过对同一供试样品溶液，在室温25℃条件下存放，每相隔24 h，连续测定3 d，其检测含量RSD见表4。
表4 重现性试验
表4 重现性试验
由表4可知，样品中维生素B1、维生素B2的检测含量RSD分别在4.67%～5.86%、0～1.64%，平均值RSD分别为0.47%、0.82%，说明供试样品溶液在室温25℃条件下放置3 d后，样品成分含量稳定，检测方法准确可靠。
2.6 样品测定
为了考察此方法的实用性，随机对2种功能性维生素饮料进行了分析，结果如表5所示。
表5 样品测定结果
由表5可知，该方法同时测定维生素B1、维生素B2的相对偏差在1%～5%，说明检测结果与实测结果较为接近，能满足同时测定功能性饮料中维生素B1、维生素B2含量的要求。
维生素B1、维生素B2标准品及样品色谱图见图2。
由图2可知，标准品中维生素B1、维生素B2的保留时间分别在2.620、10.108 min，样品1中维生素B1、维生素B2的保留时间分别在2.573、10.160 min，样品2中维生素B1、维生素B2的保留时间分别在2.641、10.331 min，表明本试验建立的方法能确保使样品与标准品中的检测物质出峰时间相一致，偏差较少，建立的方法较好。
3 结论
目前中国逐步成为全球最大的饮料市场，不仅展现了巨大的发展潜力，更遑论未来的发展势头，而其中功能饮料和健康饮料将发挥更大的发展空间。市场上功能性饮料成分呈现多种多样，单一成分检测难以满足现今实验室检测要求，因此本试验通过建立高效液相色谱法同时测定功能性饮料中的维生素B1、维生素B2含量的方法，提高实验室分析检测效率。对色谱条件进行了试验及优化验证，以C18色谱柱（4.6 mm×150 mm,5μm）为分离柱，用0.1%三氟乙酸和乙腈以不同比例混合进行梯度淋洗，使用紫外检测器在280 nm处测定。结果表明，维生素B1、维生素B2的质量浓度分别在0～80μg/m L、0～40μg/mL范围内与其峰面积呈线性关系，R2分别为0.999 98、0.999 99，线性关系较好；检测方法的精密度RSD分别为0.50%、0.77%；样品加入标准品后测得回收率分别在94.17%～97.78%、94.12%～98.53%之间，方法的最低检出限分别为0.002 8、0.000 60μg/mL，定量限分别为0.009 2、0.001 8μg/m L；最后通过抽取两个样品进行检测验证，结果得出检测相对偏差分别在2%～5%、1%～5%，检测结果与实测结果较为接近，能满足同时测定功能性饮料中维生素B1、维生素B2含量的要求。
图2 维生素B1、维生素B2标准品及样品色谱图
A为维生素B1、维生素B2标准品色谱图；B为样品1色谱图；C为样品2色谱图。
图2 维生素B1、维生素B2标准品及样品色谱图
A为维生素B1、维生素B2标准品色谱图；B为样品1色谱图；C为样品2色谱图。
