在色谱方法开发过程中, 高柱效、高分离度是一贯追求的目标, 而色谱柱和流动相的选择特别地被关注[1]。流动相是影响高效液相色谱 (HPLC) 性能的重要因素[2], 其性质包括有机溶剂的种类、配比和p H值等, 对保留时间、峰形和分离度都有影响, 这些直接对实验结果产生不可忽视的作用, 因此正确的选择流动相是至关重要的。本文探讨了反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 中如何正确快速地选择流动相, 并且优化最佳分离条件。
1 分析样品的组成及性质
在色谱方法建立之初, 对样品的化学组成和理化性质要有一定的了解, 才能确定与选择出最佳的初始分离模式。
1.1 样品的相对分子质量
考虑到多肽的相对分子质量大和组成复杂, 并且其保留行为对有机溶剂比例的微量变化非常敏感, 等度洗脱时分离结果的重现性差, 白泉等[3]就分别对多肽32、21设计了5、6种线性梯度洗脱方式进行流动相优化, 最终各自优化出一种线性梯度方式, 分离、纯化和制备出高纯度的两种多肽。样品的相对分子质量对初始条件的选择是有影响的, 对于相对分子质量大的样品, 如多肽、蛋白质和低聚物等生物大分子, 梯度洗脱是最好的选择[4]。对于低相对分子质量的样品, 需要通过分析样品性质, 如溶解性、分子极性及化合物结构、特殊官能团等, 选择适宜的流动相及分离模式。
1.2 样品的溶解度
了解样品在有机溶剂中的溶解度, 根据“相似相容”原理, 初步判断样品是极性还是非极性化合物。若样品溶解于己烷、庚烷等非极性溶剂时, 即为非极性样品, 可以考虑使用正相色谱;若样品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等极性溶剂时, 即为极性样品, 考虑的分离模式就是反相色谱。如果样品溶于水, 就首先检查水溶液的p H值。
1.3 样品的酸碱性
当样品中有酸或碱性物质时, 在实际的RP-HPLC工作中, 常加入酸[5]、碱或缓冲液作为离子抑制剂来抑制被测物解离。较常用的是缓冲盐, 其不仅可以控制流动相的p H值, 还起到提高保留时间的重现性和改善峰形的作用[6]。陈丹[7]在用ODS-C18色谱柱分析间苯三酚时, 发现当流动相为水–有机相系统时, 间苯三酚的峰有严重拖尾现象, 峰形较差。分析原因可能是间苯三酚呈弱酸性, 在该系统下呈解离状态, 最终优化的流动相为乙腈–磷酸盐缓冲溶液 (6∶94) 。此时主峰与杂质峰完全分离, 并且其峰形良好。
1.4 样品的稳定性
Ghari等[8]用一种简单的RP-HPLC-UV法代替了《美国药典》中阿奇霉素的检测方法, 研究中考察了流动相不同p H值时样品的分离情况。当流动相p H值为6时, 阿奇霉素峰拖尾严重, 这是由于阿奇霉素在酸性溶液中不稳定;当流动相用10%Na OH溶液将p H值调至8时, 则获得了良好的峰形, 并与其他杂质分离情况良好。因此, 选择流动相时, 应首先考虑样品在该流动相体系中是否稳定存在。
1.5 对映异构体
当样品中有对映异构体时, 就要考虑在流动相中加入手性衍生化试剂[9]或使用手性色谱柱[10]。
2 改变选择性和分离度
执行初始分离条件时, 会出现各种各样的问题, 如保留时间过短或过长、分离度达不到要求、拖尾严重等, 通过调节有机溶剂和添加剂的性质, 可控制选择性和分离度, 达到最佳分离效果。
2.1 有机溶剂对分离的影响
有机溶剂的种类和配比决定流动相的极性, 即洗脱能力。这对出峰时间、峰形、分离度等有着不可忽视的作用。
2.1.1 有机溶剂比例对分离的影响
初始分离条件中, 一般有机溶剂的比例定为80%, 然后逐步减少有机相比例, 直到保留因子 (k) 落在所期望值的范围内, 即1≤k≤10, 再考虑分离度、拖尾因子和出峰时间等, 优化出合适的流动相比例。Snyder等[11]在分离4种硝基取代苯混合物时, 流动相是乙腈和水, 以80%的乙腈作为初始分离条件, 其保留时间很短 (k=0.3) , 并且几种物质的分离度几乎为零;接着改用50%乙腈, 样品的保留范围比较合理 (0.9≤k≤4.2) , 但是分离度仍不符合要求, 进一步减少至40%乙腈, 保留因子范围是4.0≤k≤10, 分离度为1.4, 仍不符合要求。如果再继续减少乙腈比例, 保留因子就有可能大于10, 因此就需要采用其他方法来改变选择性和分离度。
2.1.2 有机溶剂种类对分离的影响
如上述Snyder等[11]的分离试验, 调整有机溶剂比例仍无法达到要求时, 就要考虑换有机溶剂的种类。较常用的是乙腈和甲醇。贾涛[12]以甲醇–水 (65∶35) 为流动相检测左炔诺孕酮时, 不管何种比例, 检测出的杂质都比较多, 且分离度不符合要求, 就考虑用乙腈代替甲醇, 结果左炔诺孕酮出峰时间合适, 并与其他杂质分离情况良好。
当单独使用乙腈和甲醇都不能满足要求时, 就可以考虑将两者混合使用。Kurade等[13]用C18色谱柱, 分离雷米普利和替米沙坦时, 当单独用缓冲盐–乙腈和缓冲盐–甲醇为流动相时, 分离度、拖尾因子和保留时间均不符合要求, 考虑用甲醇和乙腈的混合物, 最终优化的流动相系统为磷酸二氢钾缓冲液 (用磷酸调p H值至3.4) –甲醇–乙腈 (15∶15∶70) , 结果显示雷米普利、替米沙坦的保留时间分别为3.68、4.98 min, 二者分离情况良好。
若不能用等度洗脱分离样品时, 梯度洗脱是一种非常好的方法。丁素玲等[14]在检测盐酸帕洛诺司琼的有关物质时发现, 有一中间体的保留时间是主峰出峰时间的9~10倍, 为了缩短分析时间, 采用了梯度洗脱, 缩短了二者的出峰时间差距, 并且分离度也符合要求, 减少了时间和试剂的浪费。利用RP-HPLC同时测定阿托伐他汀和7种相关杂质的量, 由于8种物质的保留范围宽, 考虑梯度洗脱, Petkovska等[15]采用全因子变量设计, 通过对有机溶剂比例、有机混合溶剂中四氢呋喃的比例和梯度时间的考察, 最终确定了有机溶剂的变化比例是35%~75%, 有机混合溶剂中四氢呋喃的比例是10%, 梯度洗脱时间是10~20 min。在上述条件下, 阿托伐他汀和7种相关杂质分离情况良好。
2.2 缓冲盐对分离的影响
缓冲盐的种类、p H值和浓度直接影响缓冲盐的离子强度, 而流动相的离子强度对可解离化合物的色谱峰形具有显著影响, 原因在于色谱柱的过载效应随着流动相离子强度的增加而减弱[16]。
2.2.1 缓冲盐种类对分离的影响
《中国药典》2010年版[17]中测定头孢呋辛钠中头孢呋辛时, 流动相为乙酸盐缓冲溶液 (用5 mmol/L乙酸钠和0.1mol/L乙酸调p H值至3.4) –乙腈 (10∶1) , 与《英国药典》[18]和《美国药典》[19]不同的是用了C18色谱柱, 结果峰形呈三角形, 拖尾因子、峰宽和分离度均不符合要求。当改用甲酸盐时, 同时流动相进一步优化成甲酸盐缓冲液 (用80 mmol/L甲酸钠和0.14 mol/L甲酸调p H值至3.4) –乙腈 (9∶1) , 即使用C18色谱柱也能得到较好的峰形, 原因在于甲酸的p Ka值为3.7, 乙酸p Ka值是4.7, 甲酸的p Ka值与流动相的p H值接近。选用p Ka值与流动相p H值越接近的缓冲盐, 其离子强度越强, 即缓冲容量越大, 易得到较好的峰形。
2.2.2 缓冲盐的p H值对分离的影响
如上所述, 流动相的p H值除了与缓冲盐本身的p Ka值有关外, 也应该考虑分离样品的p Ka值, 使样品在该p H值条件下, 能以分子状态存在[20]。马志新等[21]依据离子抑制色谱, 用反相键合硅胶柱, 含18%的甲醇–p H 3.5的50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相, 成功分离了含有丁二酸、戊二酸、己二酸的混合二元羧酸。丁二酸、戊二酸、己二酸的各步p Ka值均在4~6, 用磷酸盐缓冲溶液, 调节p H值至3.5, 3种酸都以游离状态存在, 减弱了与固定相的保留, 获得了良好的分离效果。阿托品有叔胺结构, 呈碱性, 在ODS色谱柱上保留时间很短, 张国柱等[22]用磷酸将三乙胺溶液的p H值调至7.5, 使阿托品由解离状态转为游离态, 从而增加了其在色谱柱上的保留。流动相的p H值高于或低于被分析物的pka值两个p H值单位时, 有助于获得尖锐的峰形, 化合物99%以一种形式存在[23]。
2.2.3 缓冲盐的浓度对分离的影响
缓冲盐浓度越大, 其离子强度越强, 对峰形的改善越明显。《美国药典》[24]测定青霉素G钾中青霉素G时, 流动相为甲醇–p H 4.3的10 mmol/l磷酸二氢钾缓冲盐, 当进样量大时, 其峰形拖尾严重。综上所述, p H值为4.3时, 缓冲盐的缓冲容量几乎为零, 导致缓冲液过载, 当用磷酸调p H值至3.5时, 峰形有所改善, 但仍有拖尾。于是考虑增加缓冲盐浓度, 增加至50mmol/L时, 峰形进一步改善。
2.3 特殊的添加剂对分离的影响
当被测化合物带有强离子官能团时, 如磺酸基、羧基、胺基和铵基等, 在反相色谱柱上几乎无保留, 给药物的分离分析带来巨大困难。参考中性化合物, 一般在流动相中加入离子对试剂, 与被分析组分的离子生成不带电荷的中性离子对, 从而增加与固定相的作用, 改善了分离效果[25]。
2.3.1 碱性离子对试剂
碱性离子对试剂较常用的是高氯酸盐和烷基磺酸盐。陈红等[26]用C18色谱柱, 测定噻托溴铵的两种中间体, 即二 (2-噻吩基) 乙醇酸东莨菪酯和2, 2-二噻吩基乙醇酸甲酯, 实验过程中发现:由于两种化合物结构含有极性基团和N、S原子, 会部分质子化而带正电荷, 与硅胶柱上残留的硅醇基相互作用, 当不加离子对试剂时, 峰形拖尾严重。因此, 在流动相中加入离子对试剂戊烷磺酸钠, 形成中性离子, 改善峰形和分离效果。王鹛嵩等[27]以C18色谱柱, 实验初期选用乙腈–磷酸盐缓冲液和甲醇–磷酸盐缓冲液作为流动相, 定量分析血液中二甲双胍的浓度, 无论怎么改变有机相比例和缓冲盐性质, 二甲双胍的保留时间很短, 与血浆中杂质分不开。在酸性条件下, 加入十二烷基磺酸钠, 得到了满意的分离效果。
另一种分析碱性化合物时, 抑制固定相残留硅醇基作用的添加剂是胺[28], 最常用的是三乙胺。El-Enany等[29]用反相液相色谱法测定了格列苯脲片剂的量时, 最初始无论是选用的甲醇–水、甲醇–缓冲盐或乙腈–水为流动相, 拖尾因子高达2.0。实验证实, 流动相中加入三乙胺后, 改善了峰拖尾, 获得了满意的分离效果。
2.3.2 酸性离子对试剂
《中国药典》2010年版中, 采用高效液相色谱测定氟喹诺酮类药物时, 一般用反相柱和磷酸盐缓冲液–甲醇或乙腈作流动相, 几乎可适用于所有的氟喹诺酮类药物[17]。考虑到喹诺酮类药物具有两性基团[30], 在水溶液中通常以离子形式存在, 与柱填料表面残存的硅醇基有强烈吸附作用, 导致色谱峰易出现拖尾现象。根据离子对色谱理论, 在流动相中加入反离子对试剂进行分析。孙汉文等[31]将四丁基溴化铵作为离子对试剂加到乙腈–水流动相中, 分别以磷酸和三氟乙酸调节流动相p H值至2.87, 成功分离了依诺沙星、氟罗沙星、培氟沙星、洛美沙星、环丙沙星和恩氟沙星等7种氟喹诺酮类药物。
3 其他方法
很久以来, 国内外色谱工作者们结合数学知识、统计学方法和计算机软件等技术, 建立了许多优化流动相的方法, 如单纯形法、四面体法、图形法和人工神经网络等, 为流动相的选择和优化提供了科学依据。
3.1 数学和统计知识的应用
早在18世纪, 色谱工作者就利用数学知识和统计学方法, 就提出了许多流动相优化的方法。如单纯形法、四面体法和实验设计技术。Imam等[32]根据混合设计技术设计实验, 同时优化了流动相组分的配比和浓度, 并绘制了保留时间和峰面积与流动相组分浓度和配比的三维反应面图, 用此图选择出分离利培酮的最佳条件。Nakov等[33]用一种快速高效的亲水作用液相色谱法 (HILIC) , 同时分离了亚胺培南及降解杂质硫霉素和西司他汀, 研究中采用中心组合实验设计法优化流动相, 结果显示三者分离情况良好。
3.2 图形技术的应用
对已知样品的分析, 色谱工作者多采用窗口图形法 (WD) 和重叠分辨率法 (ORM) 。Weyland等[34]在WD基础上, 采用了非线性模型, 成功分离了11种磺胺类药物。
3.3 人工神经网络的应用
人工神经网络 (ANN) 是一种应用类似于大脑神经突触联接的结构进行信息处理的数学模型。如今, 大多数色谱工作者, 在建立ANN模型之前, 会构建一个特殊的色谱响应函数。Du等[35]证实了ANN和新的色谱响应函数的有序结合, 是一种灵活和高效的流动相优化方法。Jansen等[36]构建人工神经网络–遗传算子 (ANNGA) 模型, 并用实验验证了该模型的可行性, 成功分离了4种胆固醇酯、胆固醇和3-棕榈酸。
3.4 计算机技术的应用
随着计算机技术的发展与色谱理论的深入研究, 色谱工作者也建立了计算机优化流动相方法, 为流动相的选择优化提供了更快, 更准确的方法。人机界面 (HCI) 是用于确定色谱最佳分离条件的软件之一, 由韩国仁荷大学高纯度分离研究室设计并编程。金银哲等[37]利用HCI程序确定了5个儿茶酚化合物在色谱分析中的最佳流动相条件, 并完全分离了这5种物质。
4 结语
对于大多数的研究者来说, 流动相的选择和优化是整个色谱方法开发过程中的难点, 也是最耗时耗力的一部分。本文仅简单介绍了流动相溶液中的有机溶剂、缓冲盐和一些特殊的添加剂对分离的影响, 即在反相高效液相色谱方法建立前, 应先分析药物的基本结构, 掌握其物理化学性质, 特别是药物的极性或解离性和酸碱性, 确定初始分离条件, 再根据出现的具体问题, 结合日常实践经验的积累、相关文献和影响分离的因素, 改变选择性和分离度, 正确快速地优化出最佳的流动相组成, 为实验者选择和优化流动相提供简单参考。
然而对于相对分子质量较大、成分和组成复杂的样品, 以及那些中药成分和生物大分子样品, 这些是远远不够的, 这就需要研究者们在实践中不断总结, 不断积累, 分享出更多有价值的经验, 并且充分利用计算机软件系统, 构建一套完整系统的流动相选择优化的理论。
