随着中国渔业的发展,对饲料的需求量日益增大,使得鱼类饲料工业迅猛发展,饲料中大部分为花生、玉米、大豆等原料,在高温、潮湿条件下极易受霉菌毒素的污染,其中黄曲霉毒素B1的污染造成的损失尤为严重,也是对动物及人类危害最大的霉菌毒素。为此,笔者查阅最新国内外研究资料并进行归纳总结,分别介绍了黄曲霉毒素B1的检测方法,比较了各种方法在实际应用中的优缺点,并对检测方法进行了展望,以期为黄曲霉毒素的检测和研究提供帮助。
1 黄曲霉毒素的基本性质及其危害
黄曲霉素(AFT)是一类化学结构类似的次级代谢产物,均为二呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是一种次生代谢产物[1],是由黄曲霉和寄生曲霉产生,由于在紫外线下荧光颜色的不同,将其分为蓝紫色荧光的B族,和黄绿色荧光的G族及其衍生物,见图1。目前已经分离出20多种,包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等,它们的化学结构类似,但具体结构有所不同,凡是二氢呋喃环末端有双键的毒性较强,按毒性从大到小依次为:AFB1、AFM1、AFG1、AFB2。在食物中黄曲霉素B1最为常见,是目前已知的最强的化学致癌物之一。AFT难溶于水及甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂,在强酸性溶液中稍有分解,在pH值9～10的强碱溶液中可以快速分解成为无毒的盐,在自然条件下黄曲霉毒素稳定性很强,紫外线条件下对低浓度的黄曲霉毒素有一定的破坏性。
图1 黄曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化学结构
2 黄曲霉毒素的毒理效应及其危害
黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物之一,其毒性为KCN的10倍,是砒霜的68倍,能使禽类、鱼类、灵长类等动物诱发肝癌,主要表现为肝部坏死、出血以及肝硬化等[2,3]。鱼类采食黄曲霉毒素后会导致其采食量下降,体重下降,影响营养物质的吸收,与其他外源污染物一样,长期的黄曲霉毒素摄入会影响动物的免疫系统,抑制动物的自然免疫。早在1993年黄曲霉毒素就被世卫组织列为一级致癌物质[4],国内外科研工作者也对该毒素的研究产生了极大的兴趣[5,6],研究表明,用含有浓度为0.015 mg/kg黄曲霉毒素B1的饲料投喂小鼠,68～82周后小鼠肝部发生病变,用含有浓度为0.1 mg/kg黄曲霉毒素B1的饲料投喂鳟鱼,26周后出现肝癌[7]。 黄曲霉毒素对人类和动物健康的危害主要是由于黄曲霉毒素抑制体内蛋白质的合成,黄曲霉毒素中产生毒素的重要结构是双呋喃环[8],该霉毒素对细胞有毒害作用,该毒素首先干扰DNA与mRNA的合成,进而再影响蛋白质的合成,最终导致整个机体的损害[9,10]。黄曲霉毒素只有在机体内代谢活化之后才会表现出剧毒性[11],其中因黄曲霉毒素与DNA的络合导致的突变而引起的癌症备受关注。黄曲霉毒素除了对肝脏有影响之外,对其他系统也会产生影响,如生物体摄入黄曲霉毒素后,会破坏其造血功能,导致血液成分的变化,还会导致机体免疫力降低等。鱼类摄入含有黄曲霉毒素的饲料后,黄曲霉毒素会通过新陈代谢蓄积在鱼体的各个组织,经尿液排出一部分后,仍有大部分残留在肉中,因此黄曲霉毒素一方面直接影响动物机体健康,同时毒素也会转移到肉中,通过食物链来威胁人类健康[12]。并且,黄曲霉毒素的毒性还可通过母体传递,对胚胎免疫系统的发育产生影响,导致胚胎免疫机能受损,具有致畸、致癌作用,所以控制好饲料中黄曲霉毒素的含量,保证水产品的质量安全就是对人类健康的保护。
3 黄曲霉毒素残留检测技术
目前现有国内外对于饲料中黄曲霉毒素的检测方法种类繁多,大多集中于理化检测法和免疫学检测法,本文将对现有的黄曲霉毒素检测方法按照理化检测法和免疫学检测法分类进行综述。
3.1 理化检测方法
3.1.1 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱法是最早检测黄曲霉毒素的方法,也是现行许多国家的作为国标的检测方法[13],薄层色谱法是样品在经过提取、净化、浓缩、分离后,在特定波长的紫外光照射下,根据其发光颜色的不同判断B族、G族,根据荧光强度判断黄曲霉毒素的含量。Marijana[14]利用薄层色谱法测定饲料中单瑞孢霉烯族毒素等,检出率达到16.8%,含量在0.05～3.4 mg/kg之间。该方法的优点是设备简单,操作方便,分析成本低,较适合对黄曲霉素B1的定性检测;其缺点是对检测的规范和熟练程度要求高,准确度低,且重复性较差。
3.1.2 高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法是检测黄曲霉毒素的国标方法之一,也是一种常用的方法,其原理是以有机溶剂和水混合作为流动相,样品通过分离、纯化和浓缩后上机,通过计算待测样品的峰面积来判断样品中毒素的含量。郑会超等[15]研究了饲料中黄曲霉毒素的检测方法,通过免疫亲和柱净化后,用荧光检测器检测,可以同时分离饲料中的4种黄曲霉毒素,灵敏度高、重复性好。高效液相色谱法的优点是检测灵敏度高,重复性好,且检出限低,缺点是前处理操作复杂、分析成本高、且需要在专业实验室经专业人员进行检测,不能满足快速批量筛查的需求。
3.1.3 亲和柱高效液相色谱法(IAC-HPLC)
亲和柱高效液相色谱法可以避免薄层色谱法和高效液相色谱法的缺点,通过免疫亲和柱与薄层色谱和高效液相色谱相结合,可以在一定程度上提高检测效率、检测结果的灵敏度和准确度,达到准确定量。姚兆兴等[16]用甲醇、水溶液作为流动相采用亲和柱高效液相色谱法提取饲料中的黄曲霉毒素,通过免疫层系柱净化后,采用高效液相色谱测定黄曲霉毒素的含量,检出限为0.5 μg/kg,且线性范围良好,精密度和准确度能够满足要求。该方法同样具有灵敏度高、检测限低等优点,并且在操作过程中检测人员无中毒危险。
3.1.4 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)
液相色谱-质谱联用法以其是一种结合了液相色谱的分离技术和质谱高灵敏度的特点,是目前应用最广的一种检测技术,经常被用作确证方法使用。朱聪英等[17]建立了液相质谱法同时测定饲料中多种黄曲霉毒素的方法,被测样品中的各组分均得到了有效的分离,检测灵敏度高,检出限为0.2 μg/kg,定量限为0.5 μg/kg,检测回收率为66%～108%,均在允许范围内。该方法在精密度、灵敏度存在一定优势,适用于定量、定性检测,且检测周期短节省时间,样品制备简单。
3.2 免疫学检测法
3.2.1 酶联免疫吸附法(ELISA)
利用ELISA检测黄曲霉毒素的原理是毒素抗原抗体直接的竞争性反应,也是我国测定饲料中黄曲霉素B1的国家标准方法之一[18]。国家标准中该方法的检出限为0.2 μg/kg。孙清[19]用酶联免疫方法检测鱼粉中黄曲霉毒素B1,检测结果与液相色谱串联质谱法检测结果相符,且线性范围良好。ELISA法灵敏度高,操作便捷,分析速度快,并且可以同时处理大批量样品,但是由于同类分子的相似性,ELISA法容易对结构类似的其它黄曲霉毒素或化学物质产生一定的交叉反应,有可能带来假阳性、假阴性结果,检验精确度有待提高。
3.2.2 免疫胶体金技术(GICT)
免疫胶体金技术的原理是让待测样品中的毒素与金标物结合,抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上黄曲霉毒素B1偶联物的免疫反应,使检测线变浅,通过检测线颜色变化进行测定[20]。胶体金免疫层析技术的优点为简单、快速、成本低廉,适用于现场检测和大规模样品筛查。但其灵敏度低和不能定量的缺点,也使胶体金免疫层析技术在一些领域内的应用受到限制。目前研究胶体金免疫层析方法与其他仪器结合,建立黄曲霉素B1快速检测综合体系将是未来的发展趋势。
3.2.3 免疫层析法(ICA)
免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速检测方法,其原理是样品在毛细管的作用下移动至固定抗体的区域后,该区域会显示一定颜色。刘艳丽等[21]建立了一种用于检测黄曲霉毒素B1的免疫层次试纸条,灵敏度为1.0 ng/mL。说明该方法有很好的应用前景。
3.2.4 放射免疫法(PIA)
放射免疫法与酶联免疫方法的区别只是标记物的不同,放射免疫法的标记物为放射性元素,一般采用元素氚为标记物,使标记物与抗体竞争结合,通过测定样品放射性的强弱来判断毒素含量的高低。闫磊等[22]通过PIA法测定牛奶中黄曲霉毒素的含量,得到检出限为0.25 μg/kg。放射免疫法的优点是测定周期短、前处理简单,缺点是放射性元素污染问题。
3.2.5 荧光偏振免疫法(FPIA)
荧光免疫分析法是一种定量免疫分析技术,原理是用荧光物质做标记,与待测样品中的抗原竞争结合抗体,通过结合物荧光偏振程度来判断样品中毒素的含量。杨晓涵等[23]利用荧光偏振免疫法检测茶中黄曲霉毒素的含量,检测限为20 ng/mL,检测范围为92.76～252.32 ng/mL。该方法的优点是操作简单、检测速度快、可进行批量检测,但易出现假阳性,且设备价格昂贵。
3.2.6 时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)
时间分辨荧光免疫分析法是使用镧系元素为标记物,利用其螯合物发光的特点,通过该技术来测定荧光来判定样品中的毒素。樊晓播[24]利用时间分辨荧光免疫分析技术检测大米、黄豆和干果中黄曲霉毒素B1,灵敏度为0.02 ng/mL。该方法在排除非特异荧光干扰的前提下大大提高了灵敏度,同时克服了同位素的污染问题。
3.2.7 免疫传感器法(IS)
免疫传感器法是一种基于抗原抗体特异性识别功能而研制的一种生物传感器。王瑞鑫[25]利用该方法包埋固定抗黄曲霉毒素B1抗体,构建一种基于石墨烯的免疫传感器,用于测定花生和玉米油中黄曲霉毒素B1,检出限为0.04 ng/mL,回收率为94%～104%,均在允许范围内。该方法虽然灵敏度高,但固化抗原抗体技术尚未成熟。
3.3 其他方法
3.3.1 电子鼻法
电子鼻是一种新兴的检测技术,是由传感系统和自动化识别系统组成的一种电子感官仪器,它是将神经、数学、物理等多方面的理论运用到一起,可以快速辨别气味和气体,建立一种气味的模型,可以检出样品的特殊气味。沈飞[26]利用电子鼻技术检测糙米中的黄曲霉毒素。这种方法是一种间接的检测方法,即不是直接检测样品中的黄曲霉毒素,而是待样品污染后检测其挥发性物质的改变。该方法为检测提供了一种新的思路,但应用较少,仍需进一步探索。
3.3.2 分子生物学检测方法(PCR技术)
近年来,随着分子生物学的发展,PCR技术在霉菌毒素的检测中得到了广泛的应用。秦文彦等[27]通过对黄曲霉毒素的基因调控,建立了单管多重PCR检测黄曲霉毒素的体系,对黄曲霉毒素的DNA样本进行检测,灵敏度为1 ng/μL。该方法具有方便快捷且成本低等优点。
4 总结与展望
4.1 总结
鱼类饲料中黄曲霉毒素的检测技术种类繁多,且检测技术趋于成熟,现将检测方法总结如表1。
表1 鱼类饲料中黄曲霉毒素检测方法对比 导出到EXCEL
|
类别 |
检测方法 |
定量/定性 |
优、缺点 |
理化
检测法 |
TLC
HPLC
LC-MS
IAC-HPLC |
定性
定量 定性
定量 定性
定量 定性 |
精密度高
灵敏度高 |
免疫学
检测法 |
ELISA
ICA
PIA
FPIA
TRFIA
IS
胶体金技术 |
半定量
定性 |
易出现假阳性 |
新型方法 |
电子鼻技术
分子生物学检测法
(PCR技术) |
定性 |
有一定局限 |
新型方法 电子鼻技术
分子生物学检测法
(PCR技术) 定性 有一定局限性
综上所述,免疫学检测法为半定量、定性检测方法,多应用于初筛或者批量检测中,准确性稍差;理化检测方法为定性、定量检测方法,稳定性、重复性、准确性较高,且液相色谱质谱联用法为国标的检测方法之一;近年来新兴起来的检测方法虽然能够达到检测效果,但仍需进一步研究。综合当前研究,液相色谱(HPLC)和液相色谱质谱联用法(LC-MS)应用最广。
4.2 展望
本文综述了多种检测黄曲霉毒素的方法,如理化检测方法、免疫学检测方法以及一些新兴的检测方法,有些虽未涉及到鱼类饲料的检测但是具有十分广阔的发展前景。密切关注国内外的新技术,推出更适合我国黄曲霉毒素的检测技术,对加强饲料安全的控制,保障人民的身体健康具有重要意义。
